Le western blot, ou immunoblot, est une méthode biochimique essentielle pour la détection, l'identification et la quantification spécifiques des protéines dans un échantillon complexe. Utilisée dans des domaines aussi variés que la recherche fondamentale, la biologie cellulaire, la biologie moléculaire, la médecine et le diagnostic clinique, cette technique repose sur la combinaison de l’électrophorèse des protéines (SDS-PAGE), de leur transfert sur une membrane, et de leur reconnaissance par des anticorps spécifiques.
Grâce à sa sensibilité et à sa spécificité, le western blot est devenu une référence dans l’étude de l’expression protéique, des modifications post-traductionnelles et des interactions moléculaires.
Principes de base du western blot
Le western blot se déroule en trois étapes principales :
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Séparation des protéines par SDS-PAGE
Les protéines dénaturées et chargées négativement par le SDS sont séparées selon leur masse moléculaire sur un gel de polyacrylamide. -
Transfert des protéines sur une membrane
Après électrophorèse, les protéines sont transférées sur une membrane (nitrocellulose ou PVDF) par courant électrique. Ce transfert permet d’immobiliser les protéines pour une détection immunologique. -
Détection immunologique
La membrane est incubée avec un anticorps primaire spécifique de la protéine cible, puis avec un anticorps secondaire conjugué à une enzyme (HRP, AP) ou à une molécule fluorescente, permettant la visualisation du signal.
Détail des étapes
1. Préparation de l’échantillon
Les échantillons protéiques (cellules, tissus, lysats) sont solubilisés dans un tampon de lyse contenant :
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SDS et agents réducteurs (β-mercaptoéthanol, DTT)
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Tampon Tris pH 6,8
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Inhibiteurs de protéases et de phosphatases
Les échantillons sont chauffés à 95°C pour assurer la dénaturation complète des protéines.
2. Électrophorèse SDS-PAGE
Les protéines sont séparées sur un gel de polyacrylamide (généralement entre 8% et 15% d’acrylamide selon la taille des protéines).
Un marqueur de poids moléculaire (ladder) est toujours chargé pour estimer la taille des protéines détectées.
3. Transfert sur membrane
Le transfert peut être :
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Électrique humide (tank) : classique, mais plus long (1 à 2 heures)
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Semi-sec : plus rapide (15 à 45 minutes), adapté aux petits gels
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Transfert à sec : par pression et chaleur, pour des résultats rapides
La membrane PVDF est préalablement activée dans le méthanol. Après transfert, la qualité est souvent vérifiée par coloration (ex. : Ponceau S).
4. Blocage de la membrane
La membrane est incubée dans une solution bloquante (lait non écrémé 5% ou BSA) pour saturer les sites non spécifiques et éviter les faux positifs.
5. Incubation avec les anticorps
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Anticorps primaire : reconnaît spécifiquement la protéine cible. Il peut être monoclonal ou polyclonal.
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Anticorps secondaire : reconnaît l’anticorps primaire. Il est généralement conjugué à une enzyme comme la peroxydase (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP).
Les incubations peuvent durer de 1 heure à toute une nuit selon la sensibilité désirée.
6. Détection
La détection dépend du type de conjugaison de l’anticorps secondaire :
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Détection colorimétrique : peu sensible, utilise des substrats insolubles colorés (BCIP/NBT pour AP)
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Détection chimiluminescente (ECL) : très sensible, basée sur la réaction enzymatique de HRP émettant de la lumière détectée par un film ou une caméra CCD
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Détection fluorescente : permet la détection simultanée de plusieurs protéines, souvent avec des anticorps secondaires Alexa Fluor, DyLight ou IRDye
Applications du western blot
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Détection de l’expression d’une protéine dans un tissu ou une lignée cellulaire
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Vérification de la surexpression ou du knock-down (silencing) d’un gène
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Identification de formes phosphorylées ou glycosylées d’une protéine
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Diagnostic de maladies : infections virales (VIH, hépatite), myopathies, maladies neurodégénératives
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Validation d’anticorps pour d’autres techniques (immunofluorescence, ELISA)
Avantages du western blot
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Très grande spécificité grâce aux anticorps
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Sensibilité élevée (détection à partir de picogrammes)
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Permet la quantification relative ou semi-quantitative
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Compatible avec de nombreux types d’échantillons
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Possibilité d’analyse multiple (multiplex) avec anticorps fluorescents
Limites du western blot
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Technique longue (souvent > 1 journée)
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Sensible à la qualité des anticorps (risques de faux positifs ou négatifs)
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Problèmes de transfert ou de non-spécificité possibles
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Quantification parfois approximative sans contrôles stricts
Bonnes pratiques
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Utiliser des contrôles de charge (actine, tubuline, GAPDH) pour normaliser les résultats
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Vérifier la spécificité de l’anticorps primaire par test d’absorption ou sur échantillon knock-out
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Respecter les temps et températures d’incubation pour chaque étape
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Éviter les bulles lors du transfert qui perturbent la migration des protéines
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Toujours inclure une échelle de poids moléculaire pour interpréter les résultats
Alternatives et innovations
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Capillary Western (Wes™) : automatisation du western blot dans des capillaires, plus rapide et quantitatif
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ELISA : alternative pour la détection quantitative sans migration
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Simple Western : systèmes microfluidiques tout-en-un
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Western blot multiplex en fluorescence infrarouge (Li-Cor) : détection de plusieurs protéines simultanément
Conclusion
Le western blot est une technique de choix pour l’analyse spécifique des protéines. Malgré l’émergence de méthodes automatisées ou alternatives, il reste une référence pour valider l’expression et la régulation de protéines cibles. Son utilité en recherche fondamentale comme en médecine en fait un outil indispensable pour tout laboratoire de biochimie ou de biologie moléculaire.