La purification des protéines est une étape essentielle en biochimie et en biologie moléculaire. Elle permet d’isoler une protéine d’intérêt à partir d’un mélange complexe, souvent issu de cellules ou de tissus. Cette étape est cruciale pour étudier les propriétés biologiques, enzymatiques, structurales ou thérapeutiques des protéines. Le choix de la méthode dépend des caractéristiques physico-chimiques de la protéine ciblée, telles que la taille, la charge, la solubilité ou l’affinité.
Dans cet article, nous explorons les principales techniques de purification des protéines utilisées en laboratoire.
1. Préparation de l’échantillon
Avant toute purification, il est nécessaire d’extraire les protéines de la source biologique. Cette phase comporte plusieurs étapes :
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Lyse cellulaire : elle consiste à briser les cellules (bactériennes, eucaryotes, végétales ou animales) pour libérer les protéines. Cela peut être réalisé par sonication, lysozyme, détergents, congélation/décongélation ou pression.
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Clarification : l’extrait brut est ensuite centrifugé pour éliminer les débris cellulaires. On obtient un extrait soluble contenant la protéine cible et de nombreuses autres.
2. Précipitation différentielle
La précipitation est une technique simple pour concentrer les protéines ou éliminer les contaminants :
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Précipitation au sulfate d’ammonium : le sel réduit la solubilité des protéines, provoquant leur agrégation. Cette méthode est utile pour la purification grossière ou pour concentrer les protéines.
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Précipitation à l’éthanol ou au TCA (acide trichloracétique) : utilisée pour extraire les protéines dans certains protocoles spécifiques.
L’échantillon précipité peut ensuite être redissous et soumis à des étapes de purification plus fines.
3. Dialyse
La dialyse est utilisée pour retirer les petites molécules (sels, tampons, inhibiteurs) d’un mélange protéique à travers une membrane semi-perméable. Elle permet aussi de changer le tampon de la solution ou de préparer un échantillon pour la chromatographie.
4. Chromatographie sur colonne
Les méthodes chromatographiques constituent le cœur de la purification protéique. Elles permettent de séparer les protéines selon des propriétés spécifiques.
a. Chromatographie d’échange d’ions
Elle repose sur la charge électrique des protéines. Deux types existent :
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Échangeurs cationiques (chargés négativement) pour fixer les protéines chargées positivement.
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Échangeurs anioniques (chargés positivement) pour les protéines chargées négativement.
La protéine est ensuite éluée en augmentant la force ionique ou en modifiant le pH.
b. Chromatographie par filtration sur gel (ou exclusion de taille)
Elle sépare les protéines selon leur taille. Les petites protéines pénètrent dans les pores du gel et sont donc éludées plus lentement. Les grosses protéines passent plus vite. Cette technique est également appelée chromatographie sur gel de perméation.
c. Chromatographie d’affinité
Elle est basée sur une interaction spécifique entre la protéine et un ligand fixé sur la matrice. C’est l’une des techniques les plus puissantes et spécifiques.
Exemples : utilisation d’un anticorps contre la protéine cible, d’un histidine-tag (His-tag) pour les protéines recombinantes, ou de glutathion pour les protéines marquées GST.
Cette méthode donne souvent une protéine très pure en une seule étape.
d. Chromatographie d’hydrophobicité
Elle sépare les protéines selon leur caractère hydrophobe. En présence de concentrations élevées de sel, les parties hydrophobes des protéines interagissent avec la matrice. L’élution se fait en réduisant la concentration saline.
5. Électrophorèse préparative
L’électrophorèse sur gel (SDS-PAGE) est généralement une technique analytique, mais elle peut aussi être utilisée pour isoler une protéine en la découpant du gel après migration.
Il existe également des systèmes d’électrofocalisation ou d’électrophorèse continue permettant la purification à plus grande échelle.
6. Ultracentrifugation
L’ultracentrifugation différentielle ou en gradient de densité permet de séparer les protéines selon leur masse ou densité. Elle est souvent utilisée dans les premières étapes, ou pour purifier des complexes protéiques ou organites.
7. Techniques modernes assistées
Aujourd’hui, la purification des protéines est souvent automatisée grâce à des systèmes comme :
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FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) : chromatographie liquide à basse pression, très utilisée.
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HPLC (High Performance Liquid Chromatography) : plus rapide et plus précise, utilisée pour les protéines sensibles ou analytiques.
Ces systèmes permettent un contrôle précis du débit, du gradient de solvant, du pH et enregistrent les données UV en temps réel.
8. Évaluation de la purification
À chaque étape, il est indispensable de vérifier :
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La pureté (par électrophorèse SDS-PAGE, spectrophotométrie ou western blot).
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L’activité enzymatique, si la protéine est une enzyme.
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Le rendement (quantité récupérée par rapport à l’extrait initial).
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La concentration, mesurée par absorbance à 280 nm ou via des kits (Bradford, BCA).
9. Stockage des protéines purifiées
Une fois purifiée, la protéine doit être stockée correctement pour éviter la dégradation :
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Température : généralement à 4 °C pour le court terme, –20 °C ou –80 °C pour le long terme.
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Ajout de stabilisants : glycérol, sels, réducteurs, inhibiteurs de protéases.
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Lyophilisation : méthode pour sécher la protéine tout en la conservant.
10. Difficultés fréquentes
La purification des protéines n’est pas toujours simple. Les obstacles courants incluent :
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Protéines insolubles ou qui forment des agrégats.
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Dégradation par les protéases cellulaires.
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Perte d’activité pendant les étapes de purification.
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Faible rendement malgré la pureté.
Il est parfois nécessaire d’optimiser les conditions d’expression, de repliement ou de tampon pour améliorer la récupération.
Conclusion
La purification des protéines en laboratoire repose sur des principes biochimiques solides, allant de la précipitation à la chromatographie d’affinité. Le choix des méthodes dépend du type de protéine, du matériel disponible et de l’objectif final : recherche fondamentale, analyse enzymatique, développement thérapeutique ou production industrielle. Maîtriser ces techniques est essentiel pour tout biologiste ou biochimiste travaillant avec les protéines.